分子伴侣领域:热休克蛋白(HSP90)抑制剂的药物潜力
(相关资料图)
分子伴侣领域的重要分支-热休克蛋白。在应激过程中参与蛋白质折叠、细胞周期调控、细胞保护等功能,在药物研发的过程中有巨大的潜力。
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分子伴侣的功能
蛋白质是构成生物体系的核心成员之一,它们参与完成生物体内所有重要的生理活动并发挥关键性作用。蛋白质的化学构成和空间结构是决定其功能和活性的基本要素,蛋白质的功能发挥取决于其正确空间结构的形成和维持,并同时依赖于其不同构象之间的动态转化,构象间的互变在各种生化过程如酶催化、蛋白质识别与组装中发挥关键性作用。一旦正确的空间结构被破坏或构象转化过程受损,蛋白质会出现行为及功能异常,并最终导致疾病的发生。
在细胞中,大多数蛋白质能够在生成的同时自发完成折叠过程,形成较稳定的天然结构。另外一些蛋白质(10% - 20%)并不能自行折叠形成正确的三级结构,他们的空间结构的形成需要在细胞中其他蛋白质分子的帮助下完成。这类介导其它蛋白质正确装配的分子被称为分子伴侣。分子伴侣帮助完成新生及应激失活蛋白质的折叠、组装、转运及降解。并和泛素-蛋白水解酶系统共同维护生物体内蛋白质的生成和降解平衡。
分子伴侣定义为可以与另一种或几种蛋白质相互作用,稳定或帮助客户蛋白质获得其功能活性构象而又不存在于其最终结构中的任何蛋白质。细胞中存在几种不同类别的结构上不相关的分子伴侣,形成协作途径和网络。这些蛋白家族的成员通常被称为应激蛋白或热休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)。
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热休克蛋白的功能与分类
热休克蛋白(HSPs)是细胞中一类高度保守的蛋白质,在正常的细胞中含量较低。当细胞面临高温、缺氧、营养贫乏、毒性物质以及过表达肿瘤蛋白等压力时,热休克蛋白被大量的诱导表达。作为分子伴侣,热休克蛋白帮助细胞中其它蛋白质保持正确的构象(图 1),避免蛋白因环境压力而发生聚集。同时,热休克蛋白通过对细胞中其它蛋白的结构活化,间接调控细胞信号通路及蛋白的转录表达。通过这一系列的作用,帮助细胞抵抗环境压力,在恶劣的环境下存活。
图1 热休克蛋白家族是细胞蛋白质质量控制系统的重要组成部分
HSPs根据其分子量进行分类,包括HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSP100 和小HSP。
HSPs在整个细胞的蛋白稳态维持中发挥着关键的调控作用,包括从头折叠,错误折叠蛋白的修复,客户蛋白运输以及协助客户蛋白降解。
功能方面,热休克蛋白具有以下特点:
Hsp70和Hsp90在蛋白对头折叠和再折叠的调控作用是ATP依赖的,在ATP存在的情况下分子伴侣识别客户蛋白的疏水性氨基酸残基片段,这些片段随后被包裹在天然折叠的蛋白质内部。与疏水链段的结合能力使这些分子伴侣能够识别许多不同蛋白质的非天然状态。然后在ATP和其他伴侣分子的辅助作用下促进天然状态蛋白质的折叠,同时将折叠后的非天然状态蛋白释放。分子伴侣与客户蛋白的结合和释放处在动态平衡状态,与分子伴侣的(重新)结合会阻止蛋白的聚集并降低自由折叠中间体的浓度,而结合疏水区域的瞬时释放对于正确折叠的进行是必需的。诸如小Hsps之类等不依赖ATP的分子伴侣可能充当缓冲聚合作用的保持酶。当折叠的速度快于聚集或伴侣结合的速度时,可以实现有效的折叠。如果折叠较慢,则可以将蛋白质转移到具有不同机械特性的分子伴侣系统中。
研究发现分子伴侣Hsp70和Hsp27是细胞死亡途径的有效抑制剂,并且在肿瘤细胞中的表达水平显著的高于正常细胞,它们可以间接刺激肿瘤的生长。程序性细胞死亡(Programmed cell death, PCD)是所有细胞都能够执行的内在机制,使细胞在死亡的同时不对机体产生损伤作用,例如活化的T细胞或在组织重塑过程中牺牲的细胞。研究发下肿瘤细胞内存在一系列的PCD逃避机制。值得注意的是,Hsp70和Hsp27都通过与细胞凋亡途径中的关键分子直接相互作用,抑制肿瘤细胞PCD的发生。
Hsp27通过抑制线粒体中细胞色素C和SMAC的释放,以及拮抗Caspase 3和Caspase 9的活性促肿瘤细胞生存和增殖。
另外,Fas、TNF-α和TRAIL途径在内的其他死亡受体途径也是 Hsp27抑制的靶标。Hsp70同样是一种多功能抑制剂,可阻断PCD的c-Jun激酶途径并中断线粒体中细胞色素C的释放。
研究表明肿瘤细胞中Hsp90能够直接与端粒酶结合,保证肿瘤细胞中端粒酶活性,进而使其具备无限增殖能力。因此,肿瘤细胞中HSP90的表达水平显著的高于正常组织,Hsp90可能通过与端粒酶的相互作用抑制细胞增殖过程中端粒酶的缩短,促进肿瘤的发生和发展。
有趣的是,Hsp90 还能够与人类端粒酶基因的启动子相互作用,并增强人类癌细胞中端粒酶的表达。HSP90可能通过促进端粒酶表达和维持端粒酶活性两个方面促进肿瘤的发生。
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热休克反应
二十世纪六十年代初,Ritossa在研究果蝇唾液腺时发现了热休克反应现象。随后的研究证明,热休克反应是细胞在面对环境压力时的一种保护机制,通过诱导热休克蛋白大量表达,维持细胞活性。
诱导热休克反应的蛋白质分子被称为热休克因子(HSF)。热休克因子在不同的细胞中存在不同的亚型,但是功能却非常保守。细胞中大量未折叠的蛋白质发生聚集时,HSF1从Hsp90复合物中解离出来,形成自由态的HSF1。自由态的HSF1形成三聚体,随后多个位点被磷酸化,获得进入细胞核的能力。磷酸化的三聚体HSF1蛋白与DNA上游的启动子结合,诱导包括Hsp90, 70, 40, 27在内的热休克蛋白大量的表达(图2)。新生成的热休克蛋白帮助失活蛋白形成正确的三维构象,减少蛋白的聚集,维持细胞的正常状态。
图2 热休克反应信号通路
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热休克蛋白Hsp90的结构与功能
Hsp90的分子量大小约为90 kDa,它普遍存在于除古细菌外的原核和真核细胞中,是热休克蛋白家族核心成员之一。正常细胞中Hsp90含量为细胞总蛋白的1-2%,当细胞处于压力环境下,上升到4-6%。此外,Hsp90在进化上非常保守,它的功能在不同种属来源的细胞中保持一致。
Hsp90共包含五个亚家族成员:Hsp90A(主要分布在细胞质中,人源的胞质Hsp90包含α、β两种亚型),Trap(存在于线粒体),Hsp90B(如Grp94,内质网特有),Hsp90C(叶绿体Hsp90),Htp G(细菌中的Hsp90)(图3)。研究表明细胞质中的Hsp90β是组成型表达蛋白,非应激状态含量较高,但是只能被少量诱导;而Hsp90α为诱导型蛋白,正常状态下低表达,但在压力环境中高表达。
Hsp90的功能广泛,由它辅助完成结构活化过程的底物蛋白质(又称为“客户蛋白”)共约有300种(http://www.picard.ch/downloads/Hsp90facts.pdf),包括凋亡因子、蛋白激酶、转
录因子以及信号通路蛋白等,其中一些客户蛋白质如激素受体、表皮生长因子受体家族蛋白、间质上皮细胞转换蛋白、Raf、AKT、p53与细胞周期蛋白激酶等。
在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,Hsp90通过调控这些蛋白质的活化过程而建立起与肿瘤进程的密切关系,Hsp90是肿瘤治疗的热门靶点。
图3 Hsp90家族成员
Hsp90是ATP依赖的分子伴侣,在真核生物中必不可少。HSP90介导分子伴侣机制是真核细胞在生理和应激条件下维持蛋白稳态的关键调节剂。
HSP90对于各种客户蛋白质激活和稳定是必需的,其中许多客户蛋白质都参与重要的细胞途径。由于Hsp90影响许多生理过程,例如信号转导,细胞内转运和蛋白质降解,因此它成为了癌治疗的有趣靶标。在结构上,Hsp90是一种柔性二聚体蛋白,由三个不同的结构域组成,这些结构域采用结构上截然不同的构象。ATP 结合在这些构象变化中触发方向性,并导致更紧密的状态。为了实现其功能,Hsp90与其他辅助分子伴侣相互作用形成复杂的分子伴侣复合体,而在这个分子伴侣复合体中HSP90发挥核心的作用。
HSP90以同源二聚体的形式发挥作用,二聚化对于其在体内的功能至关重要。HSP90单体由三个高度保守的域组成:与ATP结合的氨基末端域(NTD);中间结构域(MD),对于ATP水解和HSP90与客户的结合非常重要;和负责HSP90二聚化的羧基末端结构域(CTD)。它还包含一个C端Met-Glu-Glu-Val-Asp(MEEVD)基序,这对于与含有四肽重复(TPR)域的伴侣分子的相互作用非常重要。
NTD和MD通过长而灵活的带电连接器连接,该连接器可调节NTD-MD触点并影响HSP90的功能。在没有ATP的情况下,HSP90主要采用V形开放构象。在与ATP结合后,HSP90二聚体构象发生了明显的改变,由V型开放构象变成封闭的构象,进而对客户蛋白进行正确的折叠。
图4 Hsp90的功能、结构与构象周期变化
肿瘤细胞的主要特点是大量突变蛋白的存在和快速增殖,导致肿瘤细胞似乎处于更高的“应激”状态,这给控制蛋白稳态带来了额外压力,并且肿瘤以细胞更依赖于HSP90辅助的信号通路,因而HSP90在肿瘤细胞的存活中起着至关重要的作用。除了肿瘤抑制因子p53和癌蛋白SRC以外,许多HSP90客户(例如:蛋白激酶、端粒酶、缺氧诱导因子1α和 UHRF1)也与肿瘤生长密切相关。此外,不稳定的致癌突变可能增加肿瘤细胞对HSP90的依赖性。
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Hsp90与癌症
Hsp90在多种癌症中高表达,包括卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、口咽鳞状细胞癌和多发性骨髓瘤。高表达的Hsp90被认为是膀胱癌、食管癌、肺癌、黑色素瘤和白血病预后不良的标志。
Hsp90通过稳定与激活癌症相关蛋白来调节肿瘤细胞的生长、粘附、侵袭、转移、血管生成和细胞凋亡。例如,粘着斑激酶FAK与整合素连接激酶ILK是促进细胞粘附的两个关键角色,抑制Hsp90会导致多种癌细胞中FAK与ILK蛋白的降解。
Hsp90抑制剂还可以通过抑制结直肠癌细胞中VEGF受体的表达与信号转导来抑制血管生成作用。此外,抑制Hsp90可以下调HIF-1α与NF-κB,从而抑制结直肠癌细胞的侵袭与转移。
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Hsp90全球药物研究进展
1999年,首款Hsp90抑制剂进入临床,后多个Hsp90抑制剂进入临床,并已有品种获批上市。目前已有超过三十种Hsp90抑制剂进入临床试验。其中多数抑制剂靶向Hsp90氨基端结构域的ATP 结合位点,包括格尔德霉素及其衍生物17-AAG、17-DMAG、IPI-493、IPI-504与WK88-1,根赤壳菌素及其衍生物VER-22296、AT13387、STA-9090与NVP-AUY922。
Hsp90抑制剂作为抗癌药物有以下两点优势:
(1)由于许多信号通路的关键蛋白是Hsp90的客户蛋白,因此Hsp90抑制剂可以同时靶向多个癌症相关通路,与其他单靶点治疗相比,Hsp90抑制剂对肿瘤细胞有更好的杀伤作用;
(2)由于Hsp90在肿瘤组织中高表达,因此 Hsp90抑制剂可以针对肿瘤组织进行靶向特异性损伤,而对正常组织的杀伤作用较小。
表1 全球Hsp90抑制剂药物研发情况
全球目前只有一款Hsp90抑制剂药物上市,Pimitespib。最初研发公司为Taiho Pharmaceutical(日本大鹏药品工业株式会社),是一种口服ATP竞争性HSP90抑制剂,用于治疗实体瘤,主要是胃肠道间质瘤。2022年,在日本获批上市。同时正在开展其他实体瘤适应症。
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